一、Western 及 IP 裂解液的使用方法

1. 實驗前準(zhǔn)備

• 樣本收集：根據(jù)實驗需求收集細胞或組織樣本。對于細胞樣本，貼壁細胞需先用 PBS 緩沖液輕柔洗滌 2 - 3 次，去除培養(yǎng)基殘留；懸浮細胞則通過離心（通常 500 - 1000 rpm，3 - 5 分鐘）收集，并用 PBS 重懸洗滌。組織樣本需在預(yù)冷的生理鹽水中清洗，去除血液等雜質(zhì)，并用干凈的剪刀或刀片將其剪碎成小塊。

• 裂解液準(zhǔn)備：從低溫儲存環(huán)境（-20℃或 4℃，根據(jù)產(chǎn)品說明）取出裂解液，平衡至室溫。若裂解液中蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑等為單獨包裝，需在使用前按照說明準(zhǔn)確添加到裂解液中，并充分混勻。

2. 樣本裂解

• 細胞樣本裂解：對于貼壁細胞，可直接在培養(yǎng)板中加入適量裂解液（通常每 1×10?個細胞加入 100 - 200 μL 裂解液），輕輕搖晃培養(yǎng)板使裂解液均勻覆蓋細胞表面，然后置于冰上，通過溫和振蕩（如渦旋振蕩器，低速振蕩 1 - 2 分鐘）或超聲處理（30 秒超聲，間隔 30 秒，重復(fù) 3 - 5 次，超聲功率需根據(jù)細胞類型調(diào)整）進行裂解。懸浮細胞則需先離心去除 PBS，再加入裂解液，同樣在冰上進行振蕩或超聲處理。

• 組織樣本裂解：將剪碎的組織樣本轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的勻漿器或離心管中，按照每 100 mg 組織加入 500 - 1000 μL 裂解液的比例添加裂解液。先使用機械勻漿器進行初步勻漿，使組織破碎，然后結(jié)合超聲處理進一步裂解細胞，確保蛋白質(zhì)充分釋放。

3. 蛋白質(zhì)提取

• 靜置與離心：樣本裂解完成后，將其置于冰上靜置 5 - 10 分鐘，使裂解更充分。隨后，將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，在 4℃條件下，以 12000 - 15000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，使細胞碎片、不溶性物質(zhì)沉淀于管底，而上清液即為含有蛋白質(zhì)的裂解產(chǎn)物。

• 收集上清：小心吸取上清液至新的離心管中，避免吸入沉淀。若后續(xù)實驗對蛋白質(zhì)濃度要求較高，可對上清液進行適當(dāng)濃縮處理，如使用超濾管進行濃縮。

二、使用 Western 及 IP 裂解液的注意事項

1. 裂解液儲存與保質(zhì)期

• 儲存條件：裂解液應(yīng)嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明進行儲存，多數(shù)需在 - 20℃低溫保存，避免反復(fù)凍融，因為多次凍融可能導(dǎo)致蛋白酶抑制劑等成分失活，影響裂解效果。若裂解液含有對溫度敏感的特殊成分，可能需要在 4℃保存。

• 保質(zhì)期檢查：使用前需檢查裂解液的保質(zhì)期，過期的裂解液可能因成分降解而無法有效裂解細胞或保護蛋白質(zhì)，從而影響實驗結(jié)果。若裂解液出現(xiàn)渾濁、沉淀或顏色異常等情況，應(yīng)避免使用。

2. 操作過程中的細節(jié)把控

• 低溫操作：整個樣本裂解和處理過程應(yīng)盡量在冰上或 4℃環(huán)境中進行，以降低細胞內(nèi)蛋白酶的活性，減少蛋白質(zhì)的降解。特別是對于一些不穩(wěn)定或易降解的蛋白質(zhì)，低溫操作尤為重要。

• 避免交叉污染：使用無菌的移液器槍頭、離心管等實驗器具，避免不同樣本之間的交叉污染。同時，在添加裂解液、吸取上清等操作時，要小心謹(jǐn)慎，防止液體濺出污染其他樣本或?qū)嶒灜h(huán)境。

• 裂解條件優(yōu)化：不同的細胞類型和組織樣本對裂解條件的要求可能不同，需根據(jù)實際情況優(yōu)化裂解時間、超聲功率、振蕩強度等參數(shù)。例如，對于一些細胞壁較厚的植物細胞或堅韌的組織樣本，可能需要適當(dāng)延長裂解時間或提高超聲功率，但也要避免過度裂解導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞。

3. 與后續(xù)實驗的兼容性

• 成分兼容性：確保裂解液中的成分不會對后續(xù)實驗產(chǎn)生干擾。例如，若后續(xù)要進行蛋白質(zhì)純化（如親和層析、離子交換層析），裂解液中的高濃度鹽、去垢劑等成分可能影響純化效果，需進行適當(dāng)?shù)耐肝?、稀釋或更換緩沖液等處理。若進行質(zhì)譜分析，需注意裂解液中的某些添加劑可能會影響質(zhì)譜檢測，應(yīng)選擇質(zhì)譜兼容的裂解液或進行樣品預(yù)處理。

• 實驗體系匹配：根據(jù)后續(xù)實驗?zāi)康倪x擇合適的裂解液。若進行 Western Blot 實驗，需保證裂解液能夠使蛋白質(zhì)充分變性；若進行 IP 實驗，則要選擇能夠保持蛋白質(zhì)天然構(gòu)象的溫和型裂解液，以確保蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用不被破壞。